به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، در دهه گذشته، نقش CRISPR به همان اندازه که بالقوه است به نقش  بالفعل تبدیل شده است، و تحقیقات زیست پزشکی را متحول کرده و رویکردهای کاملاً جدیدی برای تشریح تمام جنبه‌های زیست شناسی سلولی ارائه می‌دهد. در تحقیقات سرطان، CRISPR و ابزارهای مرتبط پنجره‌ای به مشکلات حل‌ناپذیر قبلی در درک ما از ژنتیک سرطان، ژنوم غیرکدکننده و ناهمگونی تومور ارائه کرده‌اند و بینش‌های جدیدی در مورد آسیب‌پذیری‌های درمانی ارائه کرده‌اند.

CRISPR و پروتئین‌های مرتبط با CRISPR (Cas) اجزای کلیدی یک سیستم ایمنی سازگار باکتریایی هستند. در طول سه دهه گذشته، صدها دانشمند به درک بیولوژی CRISPR و توسعه فناوری‌های CRISPR، از جمله مقالات برجسته که ویرایش DNA قابل برنامه ریزی در سلول‌های پستانداران را نشان می‌دهد، کمک کرده‌اند. از آن زمان به بعد، به عنوان ابزاری برای اصلاح ژنوم قابل برنامه ریزی در تقریباً همه انواع سلولی شناخته شده است.

سیستم‌های CRISPR در طیف گسترده‌ای از گونه‌های باکتریایی وجود دارند و منبع غنی از تنوع عملکردی برای ویرایش ژنوم در سلول‌های یوکاریوتی هستند. اولین مورد توصیف شده و رایج ترین مورد استفاده، سیستم CRISPR-Cas9 نوع II از استرپتوکوک پیوژنز (SpCas9)، یک اندونوکلئاز DNA است که برای القای شکستگی‌های دو رشته‌ای (DSBs) در جایگاه‌های ژنومی خاص از طریق یک RNA راهنمای قابل برنامه ریزی (gRNA) هدایت می‌شود. مولکولی که واسطه جفت شدن بازهای DNA-RNA مکمل است. برای اینکه SpCas9 به طور موثر DNA را متصل و جدا کند، دنباله هدف باید در سمت 3 توسط یک توالی موتیف مجاور پروتوسپیسر قرار گیرد. DSB ایجاد شده توسط Cas9 را می‌توان با تعمیر دقیق همسانی (HDR) یا معمولاً با اتصال انتهایی غیر همولوگ مستعد خطا (NHEJ) یا اتصال انتهایی با واسطه میکروهومولوژی حل کرد. Alt- HDR امکان ایجاد تغییرات خاص را فراهم می‌کند، در حالی که درج‌ها و حذف‌ها (indel) از NHEJ می‌توانند برای مختل کردن دنباله‌های کدگذاری و غیرکدینگ مورد سوء استفاده قرار گیرند.

از زمان اجرای اولیه سیستم‌های CRISPR در سلول‌های یوکاریوتی، گسترش سریع آنزیم‌های مختلف وجود داشته است که قابلیت‌های پلتفرم‌های مبتنی بر CRISPR را گسترش می‌دهد. یکی از منابع انواع مختلف، مجموعه متنوعی از ارتولوگ‌های Cas9 مانند استافیلوکوکوس اورئوس Cas9 (SaCas9)، یا سایر آنزیم‌های Cas (به عنوان مثال، Cas12) موجود در طیف وسیعی از گونه‌های باکتریایی است.

جداسازی drivers از passengers

توالی یابی تومور در دو دهه گذشته کاتالوگ گسترده‌ای از تغییرات ژنتیکی تقریباً از هر نوع سرطانی را ایجاد کرده است. موفقیت استراتژی‌های پزشکی دقیق در حال رشد به توانایی شناسایی جهش‌های محرکی که باعث رشد سرطان می‌شوند و جدا کردن آن‌ها از جهش‌های passengers که به پیشرفت تومور کمک نمی‌کنند بستگی دارد. قبل از CRISPR، این به مقایسه پانل‌های بزرگی از رده‌های سلول سرطانی متکی بود که دارای جهش‌های ژنتیکی مختلف، RNA مداخله‌گر کوچک (siRNA) و خاموش کردن ژن کوتاه RNA سنجاق سر (shRNA) و/یا بیان بیش از حد cDNA های جهش یافته بودند. CRISPR این رویکردها را تکمیل و گسترش داده است و امکان تولید سریع و کارآمد ناک اوت ژنتیکی (KO)، تعدیل بیان ژن درون زا و مهندسی مستقیم تغییرات ژنومی مرتبط با سرطان را فراهم کرده است.

آشکار کردن عملکرد ژن با ناک اوت CRISPR

یک رویکرد مرکزی برای درک عملکرد ژن در تومورزایی، تولید مدل‌های سرطانی از پایین به بالا است که رویدادهای مرتبط با سرطان را بازسازی می‌کند تا سهم آن‌ها در هر مرحله از فرآیند را درک کنیم. علاوه بر ساده‌سازی فرآیند ایجاد اختلالات ژنی ساده در رده‌های سلولی سرطانی، CRISPR ایجاد سریع کشت‌های ارگانوئیدی پیچیده و مدل‌های حیوانی را امکان‌پذیر می‌سازد. با توجه به سادگی و کارایی فناوری CRISPR-Cas، تولید موش‌های KO به یک روش معمول برای تاسیسات اصلی سازمانی و نهادهای تجاری تبدیل شده است. علاوه بر این، با حذف نیاز به طراحی پیچیده ناقل و غربالگری پر زحمت سلول‌های بنیادی جنینی هدفمند (ESCs)، مهندسی چندین مدل in vivo به صورت موازی یا استخراج ترکیبی از تغییرات ژنتیکی در موش های مشابه، در یک مرحله امکان پذیر شده است. چنین تلاش‌هایی با بهبود استراتژی‌های هدف‌گیری زیگوت مانند الکتروپوراسیون ریبونوکلئوپروتئین CRISPR (RNP) زیگوت‌ها (CRISPR-EZ)، الکتروپوراسیون CRISPR RNP و عفونت اهداکننده AAV (CRISPR-READI) و ویرایش ژنوم بهبودیافته از طریق انتقال اسید هسته‌ای (تحویل لوله‌ای تخمکی) امکان‌پذیر است.

غربالگری برای drivers

شاید جایی که CRISPR بیشترین تأثیر را در تحقیقات سرطان داشته است در غربالگری‌های ژنتیکی تلفیقی باشد. سهولت طراحی، شبیه‌سازی، کارایی و توسعه مداوم کتابخانه‌های sgRNA بهبودیافته، غربالگری CRISPR KO را به روشی برای بررسی عملکرد ژن در سرطان تبدیل کرده است. در رده‌های سلولی، ارگانوئیدها و حیوانات، غربالگری‌های CRISPR با انتخاب مثبت همچنان درک ما را از چگونگی مشارکت ژن‌ها و مسیرها در تومورزایی اصلاح می‌کنند. صدها نمونه از مطالعات غربالگری موثر در رده‌های سلولی وجود دارد، اگرچه CRISPR غربالگری ژنتیکی را در تنظیمات پیچیده‌تر نیز فعال کرده است. اکثریت قریب به اتفاق جهش‌ها در سرطان‌ها انواع تک نوکلئوتیدی (SNVs) هستند که ممکن است باعث تغییرات هیپو، هایپر یا نئومورفیک در عملکرد پروتئین شوند. CRISPR بر توانایی در مهندسی و مطالعه SNV ها به دو صورت عمده تأثیر گذاشته است. اول، از طریق توانایی هدف‌گیری DNA DSB، هدف‌گیری ژن مبتنی بر HDR را افزایش می‌دهد و دوم، از طریق آنزیم‌های همجوشی Cas، اصلاح مستقیم DNA را امکان‌پذیر می‌کند.

تنظیم مجدد ژنوم

بازآرایی‌های کروموزومی یک زیرگروه مهم بالینی از جهش‌های محرک سرطان هستند و شناسایی آن‌ها در دهه گذشته به طور تصاعدی افزایش یافته است. با این حال، پیامدهای عملکردی دقیق بسیاری از بازآرایی‌ها و همجوشی‌های ژن یک راز باقی می‌ماند، زیرا اغلب نادر هستند و بازآفرینی آن‌ها در سیستم‌های مدل بسیار دشوار است. CRISPR از طریق توانایی خود در کاتالیز کردن شکست‌های هدفمند DNA، ابزار قدرتمندی برای مهندسی انحرافات کروموزومی در مقیاس بزرگ است. معرفی sgRNA های جفتی که نقاط شکست فیوژن را با Cas9 هدف قرار می‌دهند، می‌تواند منجر به حذف‌های چند مگابازی شود. مطالعات اولیه امکان مدل‌سازی بازآرایی‌های کروموزومی متعدد در ریه، پروستات و کولون را با استفاده از سلول‌ها، ارگانوئیدها و موش‌ها، ساختن مدل‌های پیش بالینی برای ارزیابی حساسیت‌های دارویی بالقوه نشان داد.

مهار و فعال سازی مناطق غیر کد کننده

همانطور که در بالا ذکر شد، مهار یا فعال سازی پروموترها و تقویت کننده های ژن از طریق dCas9 امکان پذیر است. اگرچه هدف قرار دادن نواحی ژنی با dCas9 به تنهایی اتصال فاکتورهای رونویسی و RNA پلیمراز را مسدود می‌کند، به طور کلی در سلول‌های پستانداران استفاده از ماژول‌های سرکوب‌کننده رونویسی ذوب شده مانند KRAB155 کارآمدتر است.

CRISPR برای مراقبت بالینی سرطان

فن‌آوری‌های CRISPR فرصت‌های بالینی هیجان‌انگیزی در طیف وسیعی از اختلالات تک‌ژنیک دارند، اما نقش مهمی در توسعه درمان‌های سرطان نداشته‌اند. با این اوصاف، کاربردهای ملموسی برای CRISPR در مدیریت بالینی سرطان وجود دارد و در سال‌های آتی هم در تشخیص سرطان و هم در درمان‌های آن تأثیر می‌گذارد.

تشخیص سرطان مبتنی بر CRISPR

هضم آنزیمی هدفمند با واسطه ماشین آلات CRISPR می‌تواند به عنوان یک ابزار تشخیصی برای شناسایی تغییرات توالی خاص سرطان مورد استفاده قرار گیرد. ریزماهواره‌ها، یک نشانگر تشخیصی در سرطان‌ها، می‌توانند با حساسیت با استفاده از هضم با واسطه CRISPR که برای تکرارهای کوتاه پشت سر هم (STRs) که ریزماهواره‌ها را تشکیل می‌دهند، شناسایی شوند. تعیین توالی قطعات DNA حاصل (STR-seq) دقت و حساسیت بیشتری را برای تشخیص ریزماهواره به روشی با توان بالا نسبت به تکه تکه شدن توسط فراصوت نشان داد.

درمان‌های مبتنی بر CRISPR Ex vivo

برای بیوتکنولوژی که تنها 8 سال پیش ظهور کرد، قابل توجه است که اولین کاربردهای بالینی مستقیم CRISPR در حال حاضر تحقق یافته است. گروه‌های متعدد نشان داده‌اند که هدف قرار دادن PD1 مبتنی بر CRISPR بر روی سلول‌های T می‌تواند فعالیت ضد توموری را پس از انتقال پذیرفته افزایش دهد. این خط لوله درمانی در حال حاضر در آزمایشات بالینی  است. در یک مطالعه بالینی آزمایشی، سلول‌های T مهندسی‌شده ویرایش کم هدف و حداقل عوارض جانبی را نشان دادند. ویرایش CRISPR در سلول‌های انسانی بدون نگرانی نیست. Cas9 باعث برش خارج از هدف می‌شود و بازآرایی‌های کروموزومی در جمعیت‌های سلول T ویرایش شده شناسایی شده است.

پایان مطلب/.